محمد حاجی زاده

ویروس پیسک توت-فرنگی (Strawberry mottle virus) متعلق به راسته Picornavirales خانواده Secoviridae جنس Sadwavirus و زیر جنس Stramovirus می‌باشد. ویروس پیسک توت‌فرنگی یکی از مهم‌ترین ویروس‌های توت‌فرنگی است که پراکنش جهانی دارد و چند سالی است که از باغات توت‌فرنگی استان کردستان ردیابی شده است. برای شناخت بیشتر، بررسی مشخصات مولکولی RNA1 چند جدایه این ویروس مورد مطالعه قرار گرفت. برای انجام این تحقیق، چهار جدایه که دارای علائم ویروسی شامل نامتقارن بودن میوه و برگ، کوتولگی بوته، زردی و سوختگی حاشیه برگ بودند، انتخاب شدند و RNA کل آن‌ها با استفاده از روش سیلیکا از بافت برگی گیاه استخراج شد. پس از ساخت cDNA با آغازگرهای تصادفی شش‌تایی، از پنج جفت آغازگر اختصاصی که بر اساس مناطق محافظت شده RNA1 جدایه‌های مختلف این ویروس طراحی شده بودند، برای تکثیر توالی کامل RNA1 جدایه AGH استفاده شد. همچنین بخشی از ژنوم با استفاده از سه جفت آغازگر از سه جدایه PK، SD و KM تکثیر و تعیین توالی شدند. سپس، خصوصیات مولکولی، تجزیه‌وتحلیل تبارزایی و تنوع ژنتیکی این توالی‌ها همراه با جدایه‌های موجود در ژن بانک مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی تنوع ژنتیکی هرکدام از ژن‌های RNA1، نشان داد که بیشترین نسبت تعداد کل جهش‌ها مربوط به پروتئین پروتئاز با 04/0 است. همچنین کمترین میانگین تنوع نوکلئوتیدی، کمترین جهش نوکلئوتیدی و کمترین تعداد جایگاه افتراقی مربوط به ژن VPg است. نسبت جایگزینی‌های نا مترادف به جایگزینی‌های مترادف نشان داد که RNA1 این ویروس تحت ‌فشار انتخاب منفی بوده است. در بررسی تبارزایی بر اساس پلی پروتئین RNA1 و ژن پلیمراز، جدایه‌های SMoV دو گروه اصلی و چندین زیرگروه را تشکیل دادند که جدایه‌های ایرانی در گروه اول و در کنار جدایه‌هایی از کشور چک و کانادا قرار گرفتند. همچنین در بخش دیگری از تحقیق، کارایی چندین آغازگر برای ردیابی بهتر جدایه‌های ایرانی مورد مقایسه قرار گرفتند که آغازگرهای SM4F/R که بخشی از ژن پروتئاز و بخشی از ژن پلیمراز را تکثیر می‌کنند، به‌عنوان مناسب‌ترین آغازگرها معرفی شدند.

بگوموویروس‌ها به‌عنوان بزرگترین جنس ویروس‌های گیاهی سالانه خسارت هنگفتی به محصولات کشاورزی وارد می‌کنند. تعداد گونه‌های این جنس در حال افزایش بوده و سالانه تعدادی گونه جدید شناسایی می‌گردند. باتوجه به تغییرات اقلیمی انتظار می‌رود که این ویروس‌ها از مناطق و میزبان‌های جدید نیز گزارش گردند. در این بررسی، تعداد 132 نمونه از بافت برگ برخی از میزبان‌های بگوموویروس‌ها از جمله گوجه‌فرنگی، لوبیا، فلفل، بامیه، خیار، بادمجان، سیب زمینی و کدو از مزارع جالیزی و زراعی شهرستان‌های جنوبی استان کردستان (سنندج، مریوان و کامیاران) در طی تابستان سال‌های 1398، 99 و 1400 جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری بر اساس علائم بیماری، از گیاهان مشکوک به آلودگی به بگوموویروس‌ها صورت گرفت و در مواردی هم از گیاهان بدون علائم نمونه‌هایی جمع‌آوری شد. به-منظور بررسی آلودگی نمونه‌ها، استخراج DNA کل از نمونه‌ها صورت گرفته و سپس PCR با استفاده از یک جفت آغازگر دژنره اختصاصی (Bego2F و Bego2R) که بر اساس توالی حفاظت شده بگوموویروس‌ها در ناحیه‌ای‌ مشترک ژن‌های AV1، AC2 و AC3 طراحی شده بود، انجام گرفت. قطعه مورد انتظار حدود 450 جفت‌بازی در 26 نمونه از 132 نمونه مورد مطالعه (69/19% آلودگی کلی) تکثیر شد. از تعداد 26 نمونه آلوده، 11 نمونه توالی‌یابی شدند و آنالیز این توالی‌ها در نرم‌افزار MEGA X نشان داد که توالی همه نمونه‌ها مشابه هم می‌باشند و بلاست آن‌ها نیز با توالی‌یابی‌های موجود در ژنبانک نشان داد که بیشترین شباهت را به میزان 15/86% با جدایه AFTZ15A6-6 مربوط به ویروس Tomato leaf curl Uganda virus (ToLCUV) از تانزانیا دارند. این میزان تشابه با توجه به معیار تعیین‌شده برای مرزبندی گونه‌ها در جنس بگوموویروس (91%)، نشان می‌دهد که احتمالا این جدایه یک گونه مجزا بوده و نیازمند بررسی‌های بیشتر است. همچنین با ترسیم درخت تبارزایی نشان داده شد که این توالی به مجموعه بگوموویروس‌ها تعلق دارد. در این مطالعه بالاترین درصد آلودگی به‌میزان 88/28% مربوط به شهرستان کامیاران بوده و سپس شهرستان‌های سنندج و مریوان با 33/23% و 52/10 % آلودگی به ترتیب در رتبه‌های دوم سوم قرار گرفتند. در بین میزبان‌ها نیز گیاه لوبیا با 40% آلودگی، بالاترین میزان آلودگی و گیاه خیار با 66/6 درصد آلودگی کمترین میزان آلودگی را نشان دادند. با توجه به عدم مطالعه قبلی در زمینه آلودگی گیاهان مختلف به بگوموویروس‌ها در استان کردستان، این اولین بررسی و گزارش از وقوع آلودگی بگوموویروسی در این استان می‌باشد.

ویروس ساقه شیاری سیب ASGV) Apple stem grooving virus,) به دلیل انتقال آسان، تاخیر در علائم ظهور و ریشه کنی سخت یکی از ویروس های مهم درختان سیب می‌باشد. به منظور تعیین توالی کامل دو جدایه ایرانی این ویروس، یک جدایه از سنندج (K) و یک جدایه از مرند (Mn18) بر اساس نوع رقم و فاصله جغرافیایی انتخاب شدند. ژنوم این دو جدایه توسط شش جفت آغازگر اختصاصی که کل ژنوم به استثنای انتهای ناحیه poly A و ناحیه 5ˊUTR را پوشش می دادند، تکثیر و توالی یابی شد. ژنوم این ویروس در هر دو جدایه یک چهارچوب خوانش کدکننده به طول 6315 نوکلئوتیدی را تشکیل دادند که یک پلی پروتئین با 2105 اسید آمینه را کد می کنند. آنالیز BLASTn و BLASTx نشان داد که این توالی ها متعلق به ویروس ساقه شیاری سیب هستند و در مقایسه با دیگر جدایه-های این ویروس در ژن بانک، جدایه K با جدایه BR-Gala1 از برزیل و جدایه Mn18 با جدایه 13TF138 از کانادا بیشترین تشابه نوکلئوتیدی را نشان دادند. همچنین، این دو جدایه در مقایسه با هم 3/96% تشابه نوکلئوتیدی داشتند. در آنالیز نوترکیبی، سیگنالی مبنی بر نوترکیب بودن این دو جدایه شناسایی نشد. در آنالیز تبارزایی بر اساس توالی کامل ژنوم، جدایه‌های موجود در ژن بانک همراه با دو جدایه این تحقیق در دو گروه مجزا قرار گرفتند که جدایه های این تحقیق در گروه دوم و زیر گروه W1همراه با جدایه هایی از کانادا، برزیل، آلمان و چین قرار گرفتند. در بررسی ژنتیک جمعیت شش منطقه از ژنوم این ویروس، چهار منطقه دارای فشار انتخاب منفی قوی ولی دو منطقه با عملکرد نامشخص دارای فشار انتخاب مثبت بودند. بررسی های آنالیز تبارزایی و ژنتیک جمعیت این ویروس نشان داد که به احتمال زیاد شرق آسیا منشا این ویروس می باشد. این اولین گزارش از تعیین توالی کامل ژنوم ویروس ساقه شیاری سیب در ایران است.

ویروس پیسک توت فرنگی (Strawberry mottle virus, SMoV) یکی از ویروس های مهم توت فرنگی است که پراکنش جهانی دارد. در طی تابستان سال های 97-1399، تعداد 188نمونه برگی با علائم شبه ویروسی و بدون علایم به منظور ردیابی SMoV از باغات توت فرنگی استان کردستان جمع آوری شد. RAN کل از نمونه ها با روش سیلیکا استخراج و cDNA آن ها با آغازگرهای تصادفی شش تایی ساخته شد. PCR با آغازگرهای اختصاصی انجام شد و قطعه ای به طول 461 جفت باز در 51/58 درصد از نمونه های مورد مطالعه تکثیر گردید. به منظور اطمینان از نتیجه RT-PCR، پنج جدایه انتخاب و پس از اتصال به پلاسمید pTG-19 در باکتری Escherichia coli ترانسفورم و پلاسمیدهای نوترکیب همسانه شده تعیین توالی شدند. نتایج توالی یابی نشان داد که این جدایه ها بیش از 90 درصد با جدایه های موجود در ژنبانک همپوشانی در سطح نوکلئوتیدی دارند. سپس، به منظور بررسی حضور شته ناقل در باغات توت فرنگی استان، تعدادی از نمونه ها به گیاه محک Fragaria vesca با کمک شته جمع آوری شده از باغات توت فرنگی (احتمالا Chaetosiphon fragaefolii) تلقیح شدند که بعد از دو هفته علائمی شبیه به علائم ویروس SMoV در گیاه محک ظاهر شدند و آلودگی آن به این ویروس تایید شد. در ادامه این تحقیق به منظور بررسی بیشتر خصوصیات مولکولی، چند جدایه بر اساس منطقه جغرافیایی، رقم میزبان و نوع علایم انتخاب و مناطق کد شونده آران ای شماره دو شامل ژن پروتئین پوششی و پروتئین حرکتی از چهار جدایه تکثیر و توالی یابی شدند. در آنالیز نوترکیبی، اتفاق نوترکیبی در این جدایه ها مشاهده نشد و از لحاظ ماهیت سایت برشی، تفاوتی با سایر جدایه های شناخته شده این ویروس وجود نداشت. در بررسی تبارزایی هر چهار جدایه در یک کلاد قرار گرفتند. در ارزیابی فاصله ژنتیکی جدایه های این تحقیق با سایر جدایه های ژنبانک جدایه KM (مریوان) به جدایه 19SP059E از کشور کانادا (شماره دسترسی MZ328087)، جدایه PK (سنندج) و جدایه 13A(سنندج) به جدایه C از کشور جمهوری چک (شماره دسترسی MH013327) و جدایه SA(کامیاران) به جدایه T1 از کشور ژاپن (شماره دسترسی LC550286) بیشترین شباهت نوکلئوتیدی را نشان دادند. این اولین گزارش از ردیابی و تعیین مشخصات مولکولی ویروس SMoV در مزارع توت فرنگی استان کردستان می باشد.

گوجه فرنگی با نام علمی Solanum lycopersicum یکی از سبزیجات مهم مورد استفاده غذایی از تیره Solanaceae می باشد. این گیاه به علت اهمیت اقتصادی و سادگی تحقیق بر روی آن به صورت یکی گیاه الگو در علم ژنتیک و بیوتکنولوژی درآمده است. گیاه گوجه فرنگی نیز مشابه با دیگر گیاهان در معرض آفات و بیماری های متعددی از جمله بیماری های ویروسی و قارچی می باشد. از بیماری های شایع و مهم درگوجه فرنگی می توان به ویروس موزاییک خیار و لکه موجی آلترناریایی اشاره کردکه موجب خسارت در مزرعه و حتی پس از برداشت در این گیاه و محصول آن می شوند. بنابراین بررسی برهمکنش این بیمارگرها با همدیگر یکی از زمینه های تحقیقاتی جهت کنترل این بیماری ها می باشد. یکی از روش های ایجاد مقاومت به بیمارگرها، استفاده از تکنولوژی خاموشی ژن برای ایجاد مقاومت به عوامل بیماری زا در گیاهان می باشد. در تحقیق حاضر، اثر خاموشی ژن 2b ویروس موزاییک خیار در برهمکنش این ویروس با قارچ عامل لکه موجی در گیاهان آلوده به این بیمارگرها و گیاهان سالم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج تحقیق زیست سنجی در شرایط آزمایشگاهی و با استفاده ازروش برگ جدا شده در پتری(detached leaf assay )نشان داد که خاموشی ژن CMV-2b منجر به کاهش خسارت ناشی از قارچ آلترناریا در گیاهان آلوده به ویروس موزائیک خیار می شود. همچنین بررسی بیان ژن bZIP60 که در ارتباط با تنش های زیستی و غیر زیستی می باشد، با استفاده از PCR کمی ، نشان داد که ویروس موزائیک خیار باعث افزایش بیان این ژن در گیاه شده درحالی که بیان سازه ژنی خاموشی 2b pFGC-c.h)) در این گیاه باعث کاهش بیان این ژن نسبت به گیاه دارای سازه کنترل بود. نتایج این بررسی نشان داد که قارچ آلترناریا باعث کاهش بیان این ژن شده، درحالی که در آلودگی همزمان قارچ آلترناریا و CMV ، میزان بیان این ژن نسبت به گیاه سالم کاهش نشان داد. همچنین در این تحقیق اثر سازه بازدارنده مرگ برنامه ریزی شده سلولی در برهمکنش قارچ آلترناریا و CMV مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این آزمایش حاکی از این بود که سازه ژنی pPIN 253 حاوی ژن CED-9 باعث جلوگیری از القاء نکروز توسط قارچ شده درحالی که به افزایش غلظت ویروس در بافت گیاه کمک می کند. بنابراین نتایج تحقیق حاضر بیانگر تاثیر مثبت خاموشی CMV-2b در کاهش میزان خسارت قارچ آلترناریا، علاوه برویروس CMV، گیاه گوجه فرنگی بوده و این ژن را به عنوان کاندید مناسبی برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروس CMV و قارچ آلترناریا در آلودگی مخلوط این دو بیمارگر معرفی می نماید. همچنین نتایج تحقیق حاضر بیانگر این نکته بود که سازه بازدارنده مرگ برنامه ریزی شده سلولی با اینکه باعث کاهش نکروز توسط قارچ آلترناریا می شود، اما حساسیت به ویروس CMV را افزایش می دهد.

ویروس لکه سبزرد برگ سیب متعلق به جنس Trichovirus و خانواده ی Betaflexiviridae است. این ویروس گسترش جهانی دارد و در میزبان های بسیاری مانند سیب، گلابی، هلو و گیلاس گزارش شده است. هدف از این مطالعه، بیان ژن پروتئین پوششی(CP) ویروس لکه سبزرد برگ سیب در باکتری Escherichia coli بدون نیاز به خالص سازی ویروس برای تولید پادتن بود. بیان پروتئین پوششی نوترکیب، نیاز به خالص سازی ویروس را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و ژن کامل پروتئین پوششی آن به طول 582 جفت باز با آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه سازی pTG19 متصل و در باکتری E. coli سویه DH5α ترانسفورم شد. باکتری های تراریخت شده به پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین X-Gal و IPTG غربال و پلاسمید نوترکیب به روش لیز قلیایی استخراج گردید. پلاسمید استخراج شده با آنزیم های BamHl و XhoI با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند، قطعه ی مورد نظر پس از خالص سازی به حامل بیان pET28a(+)اتصال داده شد. pET28a(+) حاوی ژن CP ویروس ACLSV در باکتریBL21 E. coli ترانسفورم و سپس القای بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت SDS-PAGE بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین مذکور بود.

سیب به دلیل ارزش غذایی و صادراتی آن، یکی از محصولات مهم باغبانی در ایران به شمار می رود. در این پژوهش به منظور ردیابی و شناسایی مولکولی چهار ویروس Apple stem grooving virus (ASGV) ، (ASPV) Apple stem pitting virus ، (ACLSV) Apple chlorotic leaf spot virus و (ApMV) Apple mosaic virus ، نمونه برداری طی سال های 1396 و 1397 از برگ درختان سیب دارای علائم و در برخی موارد فاقد علائم ویروسی از باغات سیب استان کردستان انجام شد. استخراج RNA با روش سیلیکا از 174 نمونه برگی انجام شد. سپس، cDNA با آغازگرهای شش تایی تصادفی ساخته شد و حضور این چهار ویروس با آغازگرهای اختصاصی هر ویروس در آزمون RT-PCR بررسی شد. نتایج RT-PCR حاکی از آلودگی 36 نمونه به ASPV، 18 نمونه به ASGV و 17 نمونه به ACLSV بود و 17 نمونه بطور هم-زمان به چند ویروس آلوده بودند. ApMV در طی این تحقیق با وجود مشاهده علائم مشخصه آن بر روی برخی از نمونه ها، ردیابی نشد. به منظور تایید نتایج RT-PCR و آنالیز تبارزایی و تعیین مشخصات مولکولی ویروس های ردیابی شده، ژن کامل پروتئین پوششی (CP) ACLSV و ASGV بترتیب با اندازه های 589 و 714 جفت بازی از شش نمونه تکثیر و پس از اتصال در پلاسمید pTG19، در باکتری E. coli ترانسفورم و تعیین توالی شدند. همچنین، قسمتی از ژن CP از دو جدایه ویروس ASPV به صورت مستقیم توالی یابی شد. در بررسی تبارزایی،جدایه های ACLSV در گروه تبارزایی شناخته شده B6 در کنار جدایه هایی از ژاپن، چین، برزیل، لیتوانی، لتونی، هند و آلمان ، ASGV در گروه اول در کنار جدایه هایی از هند، چین، جمهوری چک، کره جنوبی، صربستان، ترکیه و ویروس ASPV در گروه اول در کنار جدایه هایی از چین، هند و کره جنوبی قرار گرفتند. میزان تنوع ژنتیکی جدایه های این تحقیق برای ACLSV و ASGV به ترتیب 007/0±0651/0 و 001/0±0053/0 محاسبه شد. همچنین دو جدایه ASPV توالی یابی شده در این تحقیق 6/99٪-3/97٪ با هم تشابه داشتند. بیشترین قرابت جدایه های این تحقیق با سایر جدایه های دنیا، در مورد ویروس ACLSV بیشترین قرابت بین جدایه D4 با BR از کشور برزیل و ویروس ASGV بین جدایه D3 با QY از کشور چین و ویروس ASPV بین جدایه NS با Palampur از کشور هند بود. بر اساس اطلاعات موجود، این اولین گزارش از حضور ASGV, ASPV, ACLSV در باغات استان کردستان هستند.

ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته داران (PNRSV) یکی از ویروس های مهم درختان هسته دار می باشد که هر سال خسارت فراوانی را با کاهش کمی و کیفی میوه ها موجب می شود. به منظور بررسی وضعیت PNRSV در استان کردستان، 149 نمونه مشکوک به آلودگی از میزبان-های هسته دار و دانه دار طی سال های 1394 و 1396 جمع آوری و استخراج RNA از بافت برگی با روش سیلیکا انجام شد. سپس، سنتز cDNA با آغازگرهای شش تایی تصادفی انجام و حضور PNRSV در نمونه ها با آغازگرهای اختصاصی ژن پروتئین پوششی در آزمون RT- PCR بررسی شدند. نتایج RT- PCR نشان داد که در مجموع 31 نمونه (8/20 درصد) آلوده به PNRSV بودند. به منظور بررسی آنالیز تبارزایی، تنوع ژنتیکی و فشار انتخاب بر ژن پروتئین پوششی این ویروس، 13 جدایه Sal53،SZ93 ، SZ26، BH11،KH10 ، DG1، B5، M، K6، S2، M4، D4 و D7 با توجه به میزبان و منطقه جغرافیایی انتخاب و ژن پروتئین پوششی آن ها پس از اتصال در پلاسمید pTG19، در باکتری E. coli همسانه سازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی شدند. توالی های حاصل سپس با 37 جدایه قابل دسترس در پایگاه داده های نوکلئوتیدی از جمله جدایه های تعیین توالی -شده از ایران مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج مقایسه دو به دوی 553 نوکلئوتیدی از ژن پروتئین پوششی جدایه های توالی یابی شده در این تحقیق نشان داد که این جدایه ها 100-96 درصد در سطح اسید نوکلئیکی و 100-92 درصد در سطح آمینواسیدی با هم تشابه دارند. بیشترین نزدیکی بین جدایه های KH10، SZ93 و D7 با جدایه SHN-40 (KX353935) از ایران با 98% تشابه مشاهده شد و کمترین نزدیکی بین جدایه SZ26 با جدایه Emp (DQ983499) از لهستان با %6/83 تشابه مشاهده شد. بررسی نوترکیبی با RDP4 نشان داد که نوترکیبی در این قسمت از ژنوم اتفاق نیافتاده است و تغییرات در اثر جهش های نقطه ای به دست آمده است. همچنین نسبت های کم جانشینی مترادف به غیر مترادف (dN/dS) نشان داد که انتخاب منفی نقش عمده ای را در تکامل این ژن ویروس بازی کرده است. در آنالیز تبارزایی، جدایه های این تحقیق به همراه سایر جدایه های ایرانی در گروه تبارزاییPV96 قرار گرفتند. بر اساس اطلاعات موجود، این اولین گزارش از حضور PNRSV در باغات استان کردستان می باشد.

ویروئیدها، مولکول های RNA، فاقد پوشش پروتئینی، حلقوی، تک رشته ای، کوچک با طول 246 تا 401 نوکلئوتید وغیر کد کننده پروتئین هستند. ویروئید موزاییک نهفته هلو Peach latent mosaic viroid (PLMVd) از جنس Pelamoviroid و خانواده Avsunviroidae، گونه های مختلف جنس Prunusرا آلوده نموده و گسترش جهانی دارد. به منظور بررسی حضور و تعیین مشخصات مولکولی PLMVd در استان کردستان، طی بهار و تابستان 1394 و 1396 تعداد 132 نمونه برگی از هلو، آلو، زردآلو، شلیل، گیلاس، بادام و آلبالو از باغات استان جمع آوری شد. استخراج اسید نوکلئیک کل با استفاده از روش سیلیکا و سنتز cDNA با استفاده از آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام شد. PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی RF44/ RF43 منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار bp350 در 36 نمونه شد.در مراحل بعدی تحقیق، فرآورده PCR نمونه های K2, K5, K6, K9, D6 و S2 به صورت مستقیم و نمونه های KH10, BH5, D1, D2, D4, K3, Ba.8, Bsh4, Bsh9, S1 و MH35 پس از اتصال به پلاسمید pTG19-T و همسانه سازی در باکتری E. coli DH5α با استفاده از آغازگر T7 promoter تعیین توالی شدند. توالی های به دست آمده PLMVd در بانک ژن ثبت و هم ردیف سازی این توالی ها با سایر توالی های این ویروئید، موجود در بانک ژن نشان داد که 97% تشابه نوکلئوتیدی بین جدایه های این تحقیق و 100-78% با سایر جدایه های گزارش شده وجود دارد. در بررسی تبارزایی، جدایه ها ی حاصل از این تحقیق با 23 جدایه ثبت شده در بانک ژن در سه گروه (I, II, III) قرار گرفتند که همه جدایه های این تحقیق در گروه I (جدایه های ایجاد کننده موزائیک) با جدایه هایی از هند، چین، اسپانیا، تونس، استرالیا و ایران هم گروه شدند. ساختار ثانویه ترسیم شده برای جدایه های D1 و KH10 حاکی از ساختارهای جدید در این جدایه ها بود. بنابر اطلاعات موجود، این اولین گزارش از ردیابی PLMVd از میزبان-های هسته دار استان کردستان و از میزبان های زردآلو، گیلاس، بادام و آلبالو برای ایران می باشد.

انگور یک فرآورده صنعتی و اقتصادی با ارزشی است که جایگاه ویژه ای را در بین محصولات کشاورزی در سراسر دنیا و ایران دارد. ویروس های خانواده Secoviridae از عوامل مهم بیمارگر انگور هستند که موجب خسارت اقتصادی در تاکستان ها می شوند. در تحقیق حاضر، نمونه برداری از تاکستان های استان زنجان در سال زراعی 96-94 به صورت انتخابی از گیاهان دارای علائم مشکوک به بیماری های ویروسی انجام شد که در مجموع 168نمونه گیاهی مشکوک به بیماری های ویروسی جمع آوری شد. استخراج آران ای کل از نمونه بافت های برگی جمع آوری شده مطابق روش روحانی و همکاران (1993) و ساخت cDNA مربوطه با استفاده از آغازگر شش نوکلئوتیدی انجام گرفت. پس از ساخت cDNA، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی هر کدام از ویروس های متعلق به خانواده Secoviridae شامل (ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور)، آزمون PCR جهت تکثیر بخشی از ژنوم ویروس ها انجام گرفت. نتایج PCR حاکی از تکثیر قطعات موردانتظار از ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور در نمونه های مشکوک مورد بررسی بود. سپس توالی برخی از محصولات PCR در مورد هرکدام از ویروس ها به دست آمد. پس از تعیین توالی محصولات PCR، همردیف سازی آن ها با سایر توالی-های موجود در بانک ژن انجام و درخت فیلوژنتیکی مربوط به هر ویروس توسط برنامه MEGA 7 ، با روش Neighbor-joining ترسم شد. نتایج حاکی از آلودگی نمونه های جمع آوری شده به ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور بود. بررسی روابط فیلوژنتیکی بر اساس توالی های اسیدنوکلئیکی نشان داد که جدایه های ردیابی شده در این تحقیق با جدایه هایی از کشورهای مختلف هم گروه می باشند که در اکثر ارتباط بین جغرافیایی بین جدایه های ردیابی شده و سایر جدایه ها را نشان می دهد.

ویروس موزاییک هندوانه (Watermelon mosaic virus, WMV) یکی از گونه های مهم جنس Potyvirus از خانواده ی Potyvirdae است. این ویروس پیکره های رشته ای انعطاف پذیر به طول حدود nm 760 دارد و ژنوم آن به صورت RNA تک رشته و مثبت می باشد. WMV در مقایسه با سایر پوتی ویروس های گیاهی دامنه ی میزبانی وسیع تری دارد و باعث خسارت اقتصادی به بسیاری از محصولات عمدتا کدوئیان می شود. به منظور ردیابی ویروس موزاییک هندوانه از جالیز کاری های استان کردستان، طی تابستان سال 1393، 56 نمونه برگی از میزبان های بادمجان، خیار، کدو، گوجه فرنگی، لوبیا سبز و هندوانه که دارای علائم مشکوک به این ویروس بودند، جمع آوری شد. ابتدا آر.ان.ای کل مطابق روش بهینه شده ی روحانی و همکاران (1993) استخراج و سپس، با استفاده از آغازگر های شش نوکلئوتیدی تصادفیcDNA مربوط به آن ها ساخته شد. در نهایت، محصولات cDNA به عنوان الگو برای تکثیر قسمتی از ژن پوشش پروتئینی ویروس موزائیک هندوانه در واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای WMV (CP-f)/ WMV(CP-r) به کار گرفته شد. نتایج الکتروفورز روی ژل آگارز 2/1%، حاکی از تکثیر قطعه مورد انتظار حدود 657 جفت بازی در 21 نمونه (37 درصد) از نمونه های مورد مطالعه بود .در کل بر اساس نتایج آرتی-پی سی آر، 35%، 55%، 17%، 40% و 67% از نمونه های مورد مطالعه در میزبان های خیار، کدو، گوجه فرنگی، لوبیا سبز و هندوانه به ترتیب آلوده به ویروس موزاییک هندوانه بودند. در حالیکه، این ویروس از میزبان بادمجان ردیابی نشد. قطعات تکثیر شده از 10 نمونه ی، B21،B22 ، C49 ،C44، W5، W1، H7، Z3، Z6، Z17 پس از اتصال به پلاسمید pTG19 در میزبان باکتریایی E.coli DH5αترانسفورم شدند. باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین،IPTG و XGal انتخاب و پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه پی سی آر، از باکتری های ترانسفورم شده استخراج گردید. قطعات پی سی آر موجود در پلاسمید های نوترکیب با استفاده از آغازگر T7- promoter تعیین توالی شدند و توالی های به دست آمده شامل 657 نوکلئوتید همراه با 81 ترادف انتخاب شده از بانک ژن مقایسه شدند. همردیف سازی های چندگانه و آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرم افزار هایMEGA6 و DNaSp انجام و درخت فیلوژنتیک به روش ماکسیمم لایکلی

ویروس برگ بادبزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) و ویروییدهای لکه زرد 1 مو (GYSVd-1 Grapevine yellow speckle viroid-1,) و لکه زرد 2 مو (Grapevine yellow speckle viroid-2, GYSVd-2) گسترش جهانی دارند. در اثر آلودگی توام این بیمارگرها بر شدت علایم افزوده و منجر به ایجاد بیماری رگ نواری می شود که به طور جدی میزان و کیفیت محصول مو را تحت تاثیر قرار می دهد. وقوع عوامل ذکر شده از اغلب مناطق اصلی کشت مو در ایران نیز گزارش شده است. از این رو، معرفی یک روش دقیق، سریع و ارزان برای ردیابی هم زمان این عوامل می تواند نقش مهمی را در جلوگیری از انتشار و گسترش خسارت آن ها و نیز غربال گیاهان سالم داشته باشد. در پژوهش حاضر یک روش(mRT-PCR) Multiplex RT-PCR جهت ردیابی هم زمان GFLV، GYSVd-1، GYSVd-2 و نیز HSVd به عنوان کنترل داخلی، با استفاده از cDNA نمونه های آلوده به این عوامل بهینه سازی شد. واکنش پی سی آر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای هر کدام از این عوامل به صورت جداگانه و یا در ترکیب با یکدیگر منجر به تکثیر قطعه های مورد انتظار در حدود 126، 229، 302 و 451 جفت باز به ترتیب مربوط به GYSVd-1، GYSVd-2، HSVd و GFLV گردید. برای اعتباردهی بیشتر، 24 نمونه از تاکستان های شمال غرب کشورکه قبلا آلودگی آن ها به ترکیب های مختلف این عوامل محرز شده بود، مجددا با این روش مورد آزمون و مقایسه قرار گرفتند که نتایج حاکی از کارایی روش بهینه شده در این تحقیق داشت. همچنین، روش mRT-PCR بهینه شده طی این تحقیق برای ردیابی این بیمارگرها از تاکستان های مختلف استان کردستان به کار گرفته شد. به همین منظور، تعداد 36 نمونه برگی از نمونه های جمع آوری شده در طی اواسط مرداد تا اواخر شهریور ماه سال 1394 مورد ردیابی قرار گرفتند. پس از استخراج آران ای کل از بافت برگ نمونه ها، سنتز دی.ان.ای مکمل توسط آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام و به عنوان الگو در آزمون mRT-PCR توسط مخلوطی از آغازگرهای اختصاصی این عوامل مورد استفاده قرار گرفت. الکتروفورز محصولات PCR بیانگر تکثیر قطعه های مورد انتظار برای GYSVd-1، GYSVd-2 و GFLV به ترتیب در 22، 21 و 7 نمونه بود. ردیابی این بیمارگرها با روش mRT-PCR از تاک های مورد بررسی نشان داد که تاکستان های استان کردستان به صورت گسترده به این عوامل آلوده هستند. برای اطمینان از اختصاصیت قطعه ها

ویروس های موزائیک خیار (CMV)، موزائیک زرد کدو (ZYMV) و موزائیک پیسک سبز خیار (CGMMV) با گسترش جهانی، دارای تهدید جدی برای محصولات کشاورزی هستند و هر ساله باعث خسارت جدی از نظر کیفی و کمی می شوند. در پژوهش حاضر به منظور ردیابی این سه ویروس از مزارع جالیز استان کردستان طی بهار، تابستان و پاییز سالهای 1392، 1393 تعداد 81 نمونه برگی بادمجان، خیار، فلفل، کدو، گوجه فرنگی و لوبیاسبز مشکوک به آلودگی جمع آوری شد. علائم عمدتاً شامل موزاییک، بدشکلی، رگ نواری، لکه های نکروتیک و کوتولگی بودند. در مایه زنی مکانیکی، عصاره برگ نمونه های مشکوک به آلودگی با این سه ویروس روی گیاهان محک سلمه تره (Chenopodium quinoa)، خیار (Cucumis sativus)، کدو (Cucurbita pepo)، توتون (Nicotiana tabacum) و لوبیاسبز (Phaseolusvulgaris) با بافر فسفات پتاسیم 1/. مولار و pH=7 مایه زنی شدند. دو نمونه W1 و ZMK4بعد از مایه زنی در گیاه خیار با ایجاد علائم بدشکلی منجر به انتقال CMV و ZYMV شدند. به منظور ردیابی ویروس های مورد نظر، استخراج آران ای کل از نمونه های مشکوک انجام و سنتز دی ان ای مکمل با استفاده از آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام شد.CMV و ZYMV در 21% از نمونه ها ردیابی شد ولی CGMMV یافت نشد. آلودگی مخلوط CMV/ZYMV در شش نمونه (5/7%) دیده شد.پی سی آر با آغازگرهای اختصاصیCMV(f)/CMV(r) و ZYMV(f)/ZYMV(r) به ترتیب منجر به تکثیر قطعه ی مورد انتظار به طول bp867 مربوط به CMVو قطعه bp432 مربوط به ZYMVاز ژن پروتئین پوششی در 17 نمونه آلوده به این ویروس شد ولیCGMMV در هیچکدام از نمونه ها ردیابی نشد.به منظور بررسی صحت قطعات تکثیر یافته فرآورده پی سی آر دو نمونه W1 و Z3 با قطعه ی bp867 به صورت مستقیم و قطعه bp432 مربوط به ایزوله B21پس از همسانه سازی برای تعیین توالی فرستاده شدندبدین منظور فرآورده پی سی آر به پلاسمید pTG19-T متصل و در باکتری E. coliDH5αکلون شد. باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین، IPTG و X-Gal انتخاب و غربال شده و پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه پی-سی آر، از باکتری های ترانسفورم شده استخراج گردید. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از آغازگر T7 promotor تعیین توالی شد و توالی های CMV و ZYMV در بانک ژن ثبت گردید. هم ردیف سازی توالی CMV،8/98 % تشابه بین ایزوله های Z3 و W1 را نشا

بیماری های ویروسی ناشی از نپوویروس ها از مخرب ترین بیماری های ویروسی مو در سراسر جهان به حساب می آیند که با نماتدهای خانواده Longidoridae منتقل می شوند. این ویروس ها غالبادارای میزبان-های طبیعی زیادی دربین گیاهان زینتی و غیر زینتی و درختان میوه و علف های هرز می باشند. پیکره اعضا این جنس دوذره ای، جورقطر و به قطر حدود 30 نانومتر می باشد. غلظت این ویروس ها در گیاه و به ویژه مو پایین است و در نتیجه ردیابی آن ها را مشکل می سازد.در این تحقیق کوشش به عمل آمد تاویروس-های مهم مو از تاکستان های استان کردستان مورد ردیابی قرار گیرد. به همین منظور در طول فصول تابستان و پاییز سال های 1391 و 1392 از تاکستان های شهرهای مختلف استان کردستان(سنندج، کامیاران، مریوان، سروآباد، اورامان، سقز، دیواندره، بانه و بیجار) نمونه برداری از درختچه های دارای علائم ویروسی و همچنین بدون علائم مشخص انجام گرفت. مجموعه ای از علائم احتمالی ناشی از ویروس که شامل زیگزاگی شدن ساقه، موزائیک، کوتاهی فاصله میان گره، دوقلو شدن جوانه،کوتولگی، رگبرگ زردی و بدشکلی می باشدبه صورت تکی یا ترکیبی از آن ها مشاهده شد. برای ردیابی دقیق نمونه های جمع آوری شده، از روش مولکولی آرتی.پی سی آر استفاده شد. به این منظور، ابتدا آران ای کل از برگ های جمع-آوری شده استخراج و تهیه دی ان ای مکمل با استفاده از آغازگر راندوم هگزامر انجام گرفت. سپس؛ آزمون پی سی آر با به کار گرفتن جفت آغازگرهای اختصاصی برای ژن رمزکننده پروتئین پوششی انجام گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ویروس هایGFLV، ArMV، ToRSV، TBRS و RbRSV به ترتیب به میزان 54/14%، 18/1%، 27/7%، 18/1% و 45/5% در بین نمونه های مورد مطالعه ردیابی شدند.ویروس هایGFLV، ArMV، ToRSV، TRSV، RbRSV برای اولین بار با روش RT-PCR از استان کردستان و ویروس های RpRSV و TRSV برای اولین بار در تاکستان های ایران گزارش می شوند.نتایج حاصل از این تحقیق بیانگر آن است که با توجه به آلودگی چند ویروس مذکور در مناطق مورد تحقیق، استفاده از روش دقیق و حساس RT-PCR برای تشخیص پایه های مادری عاری از ویروس ضروری به نظر می رسد.

ویروسY سیب زمینی گونه ی تیپ جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae می باشد. که از مهم ترین ویروس های سیب زمینی است وگسترش جهانی داشته و سبب کاهش عملکرد وکیفیت محصول سیب زمینی می شود. ذراتPVY میله ای خمش پذیر بوده و ژنوم آن به صورت RNA تک رشته ای سنس مثبت، حدود 9.7 تا 10 کیلو جفت باز است که 10-9 پروتئین را رمزگذاری می کند که یکی از آن ها CP بوده و نزدیک انتهای ´3 قرار دارد در انتهای ´5 ژنوم این ویروس VPg (پروتئین متصل ژنوم ) و در انتهای´3 به صورت پلی آدنینی قرار دارد. این ویروس از طریق تماس شاخ و برگ یا غده در بین گیاهان پراکنده می شود. اگر چه، انتقال با شته مهم ترین راه انتشار طبیعی ویروس محسوب می شود. هدف از این تحقیق، بیان ژن پروتئین پوششی ویروس Y سیب زمینی در باکتریEscherichia coli Rosetta بود تا با تولید آن، امکان تولید آنتی بادی نوترکیب در برابر آن فراهم گردد. برای این منظور بخشی از آر ان ای ویروس موجود در آزمایشگاه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی منطبق بر منطقه ژن cpاز روی cDNA سنتز شده با آغازگر تکثیر داده شد. در این تحقیق، قطعات DNA bp801 به پلاسمید pGEM-T متصل و در باکتریDH5α E. coli کلون شدند. سپس، پلاسمید نوترکیب حاوی ژن مورد نظر با روش لیز آلکالینی از باکتری های ترانسفورم شده استخراج و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و SacI برروی این پلاسمید انجام شد. قطعه مورد نظر، به حامل بیان(+) pET21a برش داده شده توسط آنزیم های BamHI و SacI اتصال داده شد. پس از بیان پروتئین پوششی PVY درE.coli وزن مولکولی پروتئین نوترکیب استخراج شده در SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. وزن مولکولی مورد انتظار این پروتئین در حدود 35 کیلو دالتون بود. نتایج به دست آمده با دو روش مذکور تایید کننده بیان ژن مورد نظر بودند.

Cucumber mosaic virus (CMV) یکی از مهم ترین ویروس های آلوده کننده اعضای خانواده کدوئیان و متعلق به جنس Cucumovirus و خانواده Bromoviridae می باشد. این ویروس دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی است و گونه های گیاهی زیادی از خانواده های مختلف را آلوده می کند. آن دارای ژنوم چند بخشی شامل سه قطعه آران ای تک رشته ای، دو آران ای زیرژنومی و در برخی از جدایه ها دارای آران آی ماهواره ای است.RNA1 به عنوان بزرگترین قطعه ژنوم ویروس بوده و دارای 3357 نوکلئوتید است و پروتئین 1a را کد می کند. RNA2 حاوی 3050 نوکلئوتید و پروتئین 2a را رمز می کند. RNA3 حاوی حدود 2200 نوکلئوتید و دارای دو سیسترون 3a و CP می باشد. پروتئین 3a توسط ORF قرار گرفته در مجاورت ´5 رمز می شود. دومین ORF موجود در ORF3، پروتئین پوششی (26 کیلو دالتون)را کد می کند که در طرف ´3 مولکول RNA3 قرار گرفته و از طریق RNA4 زیر ژنومی کد می شود. این پروتئین به همراه پروتئین 3a (پروتئین حرکتی) برای حرکت سلول به سلول در میزبان مورد نیاز هستند. پروتئین های 1a و 2a نیز در همانندسازی ویروس ضروری هستند. ذرات ویروسی چند وجهی به قطر 29 نانومتر و بدون غلاف هستند و در طبیعت توسط شته ها به روش ناپایا منتقل می شوند. این ویروس بر طبق خصوصیات سرولوژیک و ترادف نوکلئوتیدی در دو زیرگروه طبقه بندی می شوند. هدف این پژوهش، بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزاییک خیار در سیستم پروکاریوتی باکتریRosetta Escherichia coli بود. بخشی از آر ان ای سوم ویروس CMV ( استرین B13) که پروتئین پوششی را رمز می کند، قبلا با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از روی cDNA تکثیر و همسانه سازی شده بود. در این تحقیق از کلونی باکتریایی همسانه شده ی واجد pTZ57CMVCP پلاسمید رشد داده شد و به روش لیز آلکالینی استخراج شد. سپس برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و SacI برروی این پلاسمید انجام شد. قطعه مورد نظر، به حامل بیان pET21a(+) برش داده شده توسط آنزیم های BamHI و SacI اتصال داده شد و این فراورده به درون باکتری E.coli انتقال داده شد. پس از بیان پروتئین پوششی CMV در E.coli strain Rosseta gami، اندازه ی آن در SDS-PAGE بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 30 کیلو دالتون بود که بدون احتساب چند اسیدآمینه افزوده شده توسط انتهاهای N و Cحامل، با اندازه ی پروتئین پوششی CMV که KDa 26 است، مطاب